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一:对胶回收:
1. 用干净的刀片切取含DNA片段的琼脂糖凝胶(100 mg左右,尽可能多地把多余的胶切除,否则会影响回收效率),放入一干净的1.5 mL塑料离心管(自备)中称重,按重量比为1:2的比例加入通用溶胶液2.0 (0.1 g的琼脂糖凝胶需要加入0.2mL的通用溶胶液2.0)。如果琼脂糖凝胶的浓度大于2%,则需要按1:3的比例加入通用溶胶液2.0溶解胶块。
2. 50℃保温10分钟使胶完全溶化,每隔2-3分钟振荡数次以促进琼脂糖凝胶的溶化。如果片段长度在300bp以下,建议不要50℃保温,而是延长溶胶时间,以免DNA变性,影响回收率。
3. 在等待期间,活化离心吸附柱。在离心吸附柱中加入0.5mL吸附柱活化液,套上收集管后室温放置2分钟,然后12,000 rpm离心2分钟,倒弃穿透液,再将吸附柱套上收集管后待用?;罨蟮睦胄奈街匦朐诘碧焓褂?。
4. 在上柱前,在溶化的胶中加入相当于胶块体积1/2的异丙醇(对100mg胶块,加50uL),快速振荡10秒混匀。
5. 将溶液转移到离心吸附柱中,套上收集管,静置3分钟。注意:静置有助于DNA与离心吸附柱的硅胶膜结合。本产品提供的离心吸附柱的*大上样体积为0.8mL,若溶胶液的总体积大于0.8mL,一次加不完,可以分多次将溶液加入到吸附柱中。
6. 12000-15000 g离心1分钟,倒掉收集管中的穿透液。
7. 加入0.7mL通用洗柱液于离心柱中,12000-15000 g离心1分钟,倒弃收集管中的废液。如果回收的DNA用于盐敏感实验(如平末端连接或直接测序),建议加入通用洗柱液后静置2-5分钟再离心。
8. 12000-15000 g离心半分钟以去除离心柱中的残留液体。
9. 将离心柱吸附置于一新的干净的塑料离心管(自备)中,悬空加入50 uL DNA洗脱液于离心吸附柱硅胶膜的中央。注意:如果回收的DNA用于测序,则可用重蒸水(自备)洗脱DNA。DNA洗脱液可以也用TE替代,但用水或TE替代DNA洗脱液3.0时,回收率可能稍有降低。
10. 静置3分钟后12000-15000 g离心1分钟。
11. 离心管底部所得溶液即为纯化的DNA溶液,可立即用于后续实验或者放-20℃长期保存。如果将所得DNA溶液再次加回到离心吸附柱中,重复洗脱过程,将得到更多的DNA。
12. 用电泳方法或测OD方法确定回收所得DNA的浓度,1 OD260对应的浓度是50ug/mL(对双链DNA)或40ug/mL(对单链DNA),纯净DNA的OD260/OD280比值应该在1.8左右。注意:OD读数跟pH相关,如果用自备的重蒸水洗脱,OD值会低于在DNA洗脱液3.0中测定的数字。
二:PCR或其他酶反应回收
13. 直接在PCR或其他酶反应管中加2倍体积的通用溶胶液2.0,振荡10秒混匀。如果PCR反应中使用了石蜡,需要预先去除。
14. 活化离心吸附柱。在离心吸附柱中加入0.5mL吸附柱活化液,套上收集管后室温放置2分钟,然后12,000 rpm离心2分钟,倒弃穿透液,再将吸附柱套上收集管后待用?;罨蟮睦胄奈街匦朐诘碧焓褂谩?/span>
15. 在上柱前,在反应液和溶胶液的混合液中加入相当于反应体积1/2的异丙醇(对100uL的反应液,加50uL),快速振荡10秒混匀。
16. 直接进入上面胶回收操作的第5步并进行后面的操作。
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